1引言(Introduction)

甲烷(CH4)是僅次于CO2的第2種重要的溫室氣體.如何減排溫室氣體CH4成為了全1球關注的焦點.同時,生物脫氮是當前廢水處理領域的研究熱點.污水處理廠中通常通過硝化和反硝化實現生物脫氮,而目前城鎮污水普遍存在C/N比低的問題,導致在反硝化過程中往往需要大量的外加碳源.而在污水處理廠的厭氧處理過程中會產生大量的甲烷,如能將這部分甲烷作為碳源進行利用,既減少了甲烷的排放,又節省了能源的消耗.反硝化型甲烷厭氧氧化反應(DenitrifyingAnaerobicMethaneOxidation,DAMO)正是可以利用甲烷作為碳源完成反硝化脫氮的過程.DAMO過程是以甲烷為電子供體和唯1一碳源,以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體的一種氧化還原反應.2006年,該過程在實驗室中得以證實(Raghoebarsingetal.,2006).在自然界中,溶解于水中的甲烷主要靠甲烷氧化菌等通過生物作用得以消耗;現已發現在淡水系統、濕地系統、近海海洋生態系統中(Deutzmannetal.,2011;Lueskenetal.,2011;Kojimaetal.,2012;Wangetal.,2012;Hanetal.,2013;Shenetal.,2013;Shenetal.,2014)均有存在可以耦合甲烷厭氧氧化作用(AnaerobicOxidationofMethane,AOM)和反硝化作用(Denitrification)的DAMO(DenitrifyingAnaerobicMethaneOxidation,反硝化型甲烷厭氧氧化)微生物.根據系統發育分析,研究者檢測到的DAMO細菌隸屬于NC10門細菌;DAMO古菌則屬于甲烷厭氧氧化古菌ANME-2(Raghoebarsingetal.,2006).2017年,Wang等(2017)提出了側流式、主流式兩種DAMO反應應用于污水處理廠的設想.

目前污水處理廠進水多為低碳高氮性質,多種化工、制藥廢水及垃圾滲濾液等,都含有較高濃度的氨氮,而高濃度的氨氮會對活性污泥中的微生物起抑制作用(鄭雄柳等,2014),并會影響系統微生物菌群結構.目前已有研究報道高濃度氨氮對活性污泥系統中硝化細菌、厭氧氨氧化細菌等微生物具有抑制作用(Zhouetal.,2011),但對DAMO微生物的影響及機理鮮見報道.如欲將DAMO工藝應用于廢水生物脫氮,探明氨氮對該過程的影響顯得尤為重要.因此,本文利用已經成功富集的以DAMO細菌為優勢菌種的系統(以下簡稱DAMO細菌系統)(樓菊青等,2016)為研究對象,通過短期和長期試驗,從宏觀和微觀兩個層面,研究氨氮對DAMO過程脫氮性能、微生物菌群結構的影響,綜合考察DAMO細菌對氨氮的應激性、耐受性,并探索其抑制機理.為促進對DAMO微生物脫氮機理的研究和完善DAMO理論的發展添磚加瓦,為該工藝向實際工程應用推進一步.

2試驗材料與方法(Materialsandmethods)

2.1材料

2.1.1試驗系統

本文的試驗系統是基于之前已成功富集的以DAMO細菌為優勢菌種的混培物(樓菊青等,2016).所得混培物是以淡水河道(西溪河)底泥、淡水湖泊(西湖)底泥及水稻農田土壤的混合物為接種污泥,甲烷和亞硝酸鹽為唯1一碳氮源.至本試驗止,系統已穩定運行1392d.

2.1.2試驗裝置

試驗裝置為特制的直徑為7.5cm、高度為17cm的500mL厭氧反應器.

2.2試驗方法2.2.1短期試驗方法

①不同濃度氨氮對DAMO細菌的影響：通過批式實驗研究氨氮對以DAMO細菌為優勢菌種系統(以下簡稱DAMO細菌系統)的短期影響,設3個平行試驗組和一個對照組,試驗時長7d,氨氮濃度梯度分別為50、250、500、750、1000、1250、1500mg˙L-1.每12h取3mL水樣,利用0.22μm微孔濾膜過濾后進行三氮(氨氮NH4+-N、硝態氮NO3--N、亞硝態氮NO2--N)的測定.在***氨氮梯度濃度試驗后,取泥水混合液10mL進行掃描電鏡分析實驗.②不同pH體系下氨氮的影響：根據上述短期試驗結果進行批式試驗,選取750mg˙L-1氨氮作為試驗濃度.用0.1mol˙L-1HCl或0.1mol˙L-1NaOH分別將pH調節為6.5、6.8、7.0、7.5、7.85個濃度并利用pH計實時監控反應器內的pH值,使其保持在相應的范圍內,每組試驗持續7d.取樣與測定同①.當T=27℃時,不同pH體系對應的FA濃度可由公式(1)計算得到.

(1)

式中,cFA為FA的濃度(mg˙L-1);cNH4+為氨氮的濃度(mg˙L-1);T為溫度(℃)

2.2.3長期試驗方法

氨氮對DAMO細菌的長期影響試驗以短期試驗結果為依據,將長期試驗分為連續的4個階段,每個階段7d,這4個階段的氨氮濃度按照短期試驗濃度依次遞增(李媛,2014),濃度分別為500、750、1000、1250mg˙L-1,在28d后取樣進行高分子通量測序.

2.3分析方法2.3.1常規指標測定

NO3--N、NO2--N、NH4+-N測定方法參考《水和廢水監測分析方法》第四版(魏復盛,2002).

2.3.2微生物微觀形態結構分析

利用掃描電鏡對微生物微觀形態進行特性分析.在每個階段的短期試驗過程中,取10mL樣品,在4000r˙min-1條件下離心5min,取上清液,樣品處理后用掃描電子顯微鏡SEM(SU8010,Hitachi)進行微生物微觀形態的特性分析.

2.3.3微生物群落結構分析

提取長期試驗前后污泥樣品中的基因組DNA,儲于-20℃以下,并利用高通量測序分析.利用上海申能博1彩生物科技有限公司生產的3S柱離心式DNA抽提試劑盒進行樣品DNA的提取;利用特定PCR引物進行序列擴增,全部樣本按照正式試驗條件均進行3次重復實驗;參照電泳初步定量結果,將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量,之后按照每個樣本的測序量要求,進行相應比例的混合;通過構建Miseq文庫、Miseq測速對16SRNA序列進行測序;區分樣本后,采用RDPclassifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析,與Silva數據庫比對,并在門、綱、屬3個水平統計每個樣品的群落組成.

3結果與討論(Resultsanddiscussion)

3.1氨氮對DAMO細菌的短期影響

3.1.1氨氮對以DAMO細菌脫氮性能的影響

不同濃度梯度(50~950mg˙L-1)的氨氮對DAMO細菌的脫氮性能影響見圖1.其中圖1a表示不同濃度氨氮作用下,系統內亞硝酸氮的消耗曲線,圖1b表示不同濃度下亞硝酸氮的消耗速率與對照組的比值,以v表示試驗組亞硝酸氮的消耗速率,v0表示對照組亞硝酸氮的消耗速率.其中誤差范圍由標準偏差表示.

圖1

圖1不同濃度NH4+-N對DAMO細菌脫氮性能的影響(a.NO2--N消耗曲線,以N計;b.試驗組與對照組的比值)

當控制pH實驗條件為7.0時,通過公式(1)計算可知FA=4.879mg˙L-1,由圖1可見,在一1定范圍內,DAMO細菌脫氮性能隨著氨氮濃度的增加而降低.由圖1a可知,在空白對照組中,其亞硝酸鹽初始濃度為30.19mg˙L-1,7d平均消耗速率為2.92mg˙L-1˙d-1.在50、250mg˙L-1氨氮作用下,系統的亞硝酸氮的消耗速率分別為2.94mg˙L-1˙d-1和2.96mg˙L-1˙d-1.相比于對照組,消耗速率略有上升,但經過單因素方差分析后可知,其p值為0.65,大于0.05,說明3組數據無顯著性差異,從而表明在50、250mg˙L-1氨氮作用下,系統的脫氮性能并未出現抑制或促進現象(故該兩組數據未在圖1a中表示).而當氨氮濃度增加至500mg˙L-1時,7d平均亞硝酸鹽消耗速率下降為2.42mg˙L-1˙d-1,其消耗速率為對照組的82.71%.當氨氮濃度為750mg˙L-1時,7d平均消耗速率與對照組相比,下降了43.15%.當在1000mg˙L-1氨氮抑制條件下,經7d的消耗后,消耗速率下降了56.20%.在1250mg˙L-1氨氮抑制條件下,亞硝酸鹽7d平均消耗速率僅為對照組的27.27%.Dapena-Mora等的研究認為針對厭氧氨氧化細菌,氨氮的IC50為770mg˙L-1,與本試驗結果相近(Dapena-MoraA,2007),可見,DAMO細菌對高氨氮廢水表現出較強的抗沖擊負荷的能力.這有利于DAMO細菌系統在含高氨氮廢水處理廠中的應用.

3.1.2不同pH條件下氨氮對以DAMO細菌為優勢菌種系統的影響

根據3.1.1節的短期試驗結果,選取750mg˙L-1的氨氮濃度進行試驗.當T=27℃,不同pH體系下,對應的FA的濃度可由公式(1)計算得到,計算結果見表1.

圖2為不同pH時,DAMO細菌系統受氨氮影響時的脫氮性能.以pH=7.0為對照組,各pH條件下脫氮速率與該條件下脫氮速率比值為縱坐標,得圖2b,由圖2可知,在堿性條件下(pH=7.0、7.5、8.0),同樣為750mg˙L-1的氨氮,隨著pH升高,FA升高,脫氮速率下降,當pH=8.0時,其FA濃度為46.09mg˙L-1,此時脫氮速率不到對照組的1/2,且對pH=7.0、7.5、8.0條件下所得3組數據進行單因素方差分析,其p值為9.93×10-5,遠小于0.01,說明這3組數據之間有極顯著差異;而在酸性條件下(pH=6.5、6.8、7.0),雖然FA值隨著pH值的升高而升高,但通過單因素方差分析發現脫氮速率與FA值并無顯著性差異.這說明在堿性條件下,氨氮對系統的抑制效果與FA值有關,FA是限制性抑制因子,該結果與氨氮對其他微生物抑制的大多數研究結果相吻合(Anthonisen,1976);在酸性條件下,抑制效果與FA的濃度無關,認為離子化氨氮應是真正的抑制因子.該結果與之前部分研究相吻合,當溶液呈酸性(pH<7.0)時,厭氧氨氧化菌、甲烷菌、反硝化菌等微生物活性受到抑制;甲烷菌(Lay,1997)等的活性取決于離子化氨氮NH4+的濃度,而不是質子化氨氮FA的濃度.

圖2

圖2不同pH下NH4+-N對DAMO細菌系統內NO2-消耗情況及脫氮性能的影響(a.不同pH條件下NO2--N消耗曲線;b.不同pH條件下NH4+-N對系統脫氮性能的影響)

3.1.3氨氮對DAMO細菌系統的微觀形態影響

在1500mg˙L-1的氨氮抑制試驗7d后,取污泥混合液10mL離心后,利用掃描電鏡分別觀察抑制前后的污泥結構與微生物微觀形態特性,結果見圖3.由圖3可知,氨氮抑制試驗之前,在SEM下的絮狀污泥微觀結構清晰可見,細菌形狀多樣,以菌膠團的形式聚合在一起,其中占主導地位的是球狀菌和短桿狀菌,絲狀菌數量較少.菌的表面較為光滑,附著有少量胞外聚合物(ExtracellularPolymericSubstances,EPS).具體聯系污水寶或參見更多相關技術文檔。

圖3

圖3氨氮抑制前后DAMO細菌系統掃描電鏡照片(a.氨氮抑制前,b.氨氮抑制后)

經高濃度氨氮短期抑制后的污泥與抑制之前相比,結構變得松散,絲狀菌大量繁殖,球狀菌和短桿狀菌則大量減少,污泥出現了明顯的膨脹現象.而污泥中的微生物出現了明顯的皺縮現象,另外微生物表面還包裹著一層粘性物質.由于聚合物覆蓋在微生物的表面,在環境與微生物胞膜之間形成一個緩沖層,這種緩沖層有助于保護細胞體免受有毒物質損害,從生物反饋機制上理解：在環境條件改變的情況下,微生物分泌大量EPS的行為可以歸結為生物應激性的一種表現,從而能夠大程度地避免微生物細胞體受危害.所以,微生物表面包裹著的這層粘性物質應為細菌所分泌的EPS(鄭雄柳,2014),用以抵抗外界的不利因素.

3.2氨氮對DAMO細菌的長期影響3.2.1氨氮對以DAMO細菌脫氮性能的影響

氨氮對DAMO細菌系統長期抑制后對系統脫氮性能影響結果見圖4.

圖4

圖4DAMO細菌系統內NO2--N消耗曲線及長期抑制對脫氮性能的影響(a.系統NO2--N消耗曲線;b.長期抑制對系統脫氮性能的影響)Fig.4NO2--NconsumptionandnitrogenremovalperformanceinDAMObacteriaSystemunderlongterminhibition(a.NO2--Nconsumptioncurve;b.nitrogenremovalperformanceinDAMObacteriaSystem)

控制***階段(1~7d)氨氮濃度維持在500mg˙L-1左右,亞硝酸鹽初始實測濃度為29.95mg˙L-1,7d內平均消耗速率為2.37mg˙L-1˙d-1,與空白對照組相比其消耗速率下降了20.80%(圖4b),出現明顯抑制效應,此時抑制效果與短期試驗基本沒有差別.控制第二階段(8~14d)氨氮的濃度為750mg˙L-1左右,亞硝酸鹽初始實測濃度為30.95mg˙L-1,7d平均消耗速率為1.14mg˙L-1˙d-1,與對照組相比其消耗速率下降62.02%,而同樣為750mg˙L-1的短期試驗中,其消耗速率只下降了43.15%.第三階段(15~21d)氨氮的濃度控制在1000mg˙L-1左右,該階段亞硝酸鹽初始濃度為31.91mg˙L-1,7d平均消耗速率為0.54mg˙L-1˙d-1,其消耗速率僅僅達到了對照組的18.04%(圖4b),而短期試驗該濃度下的NO2--N消耗速率卻還有對照組的43.80%,可見,與短期抑制相比,在長期抑制條件下,氨氮的毒性具有累積效應.

當氨氮的濃度上升到1250mg˙L-1時(22~28d),7d內其亞硝酸氮的消耗速率僅為對照組的6.69%,且經過單因素方差分析后發現,與氨氮濃度為1000mg˙L-1條件下所得數據并無顯著性差異,從而表明當控制氨氮濃度為1000mg˙L-1時,DAMO細菌系統的脫氮性能已基本被抑制.在長期抑制試驗的pH條件下(7.0),氨氮濃度為500、750、1000mg˙L-1時,其相對應的FA分別為3.253、4.879、6.505mg˙L-1,其FA濃度依次升高,而根據3.1.2節試驗結果可知,在pH=7.0~7.5條件下,氨氮對系統的抑制效果與FA值相關,FA增加,抑制效果增強.

3.2.2氨氮對DAMO系統菌群結構的影響

本試驗利用第二代高通量測序技術Miseq高通量測序揭示氨氮抑制前后微生物群落多樣性的變化,結果詳見表2.其中,Coverage表示樣本文庫的覆蓋率,其數值越高,則樣本中序列被測出的概率就越高,該指數反應測序結果是否代表了微生物的真實情況.在本試驗中,所有Coverage指數均為99.85%,故此次測序結果真實可靠.由表2可知,在經過4周高濃度氨氮抑制之后,OTUs的數值出現了明顯的下降,DAMO細菌系統初始的OTUs為288.00,但抑制后僅為227.00,此外,表征群落豐度的指標Chao1值和Ace值也分別從320.00、328.98下降到255.27和255.64,說明在抑制過程中系統內物種數不斷減少.而表征群落多樣性的指標,Shannon指數從3.11下降到2.26;Simpson指數從0.09上升到0.11,說明抑制過程中系統內群落多樣性在不斷減少.綜上可知,氨氮對以DAMO細菌為優勢菌種的微生物系統有明顯的抑制作用,長期抑制后,微生物系統的物種豐度以及多樣性明顯下降.

基于第二代高通量測序技術Miseq高通量測序,對16SRNA序列進行測序.氨氮抑制前后DAMO細菌系統的微觀群落結構組成見圖5.

圖5

圖5氨氮抑制前后DAMO細菌系統微觀群落結構(a.氨氮抑制前;b.氨氮抑制后)

從圖5可見,氨氮對系統微生物群落結構有較大影響.

從門的層次上,氨氮抑制實驗前后均檢測到28類已知門類的細菌,其中氨氮抑制實驗前占優勢地位的是變形菌門(Proteobacteria,35.13%)、綠菌門(Chlorobi,30.25%)、浮霉菌門(Planctomycetes,14.03%)和綠彎菌門(Chloroflexi,12.54%).這幾類細菌都是厭氧脫氮生物反應器中常見的細菌(Guo,2015;Shu,2015).而在氨氮抑制實驗以后,占據優勢地位的門類細菌種類不變,但其比例已較抑制前發生較大改變,變形菌門(Proteobacteria)從35.13%上升到67.23%,綠菌門(Chlorobi)的比例從抑制前的30.25%下降到抑制后的16.94%,而綠彎菌門(Chloroflexi)從12.54%下降到3.84%,浮霉菌門(Planctomycetes)的比例從14.03%下降到1.08%.變形菌門在高濃度氨氮氮條件下比例升高,說明高濃度氨氮對其有一1定的促進作用;而對于綠菌門門、綠彎菌門及浮霉菌門,抑制作用則十分顯著.

在綱的層次上進一步分析發現,氨氮抑制實驗前,變形菌門中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Gammaproteobacteria均被檢測到,其比例分比為：8.75%,8.46%,3.09%,14.63%.但占比大的是隸屬于綠菌門的Ignavibacteria(28.72%).系統中的優勢菌群為屬于綠菌門的Melioribacter,屬于變形菌門的Methylomonas(甲基單胞菌屬),及屬于浮霉菌門的SM1A02,其比例分別為19.66%,13.84%和13.07%.其次是屬于浮霉菌門的Phycisphaerae占比13.97%,以及屬于綠彎菌門的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)占6.68%.綠彎菌門所屬細菌多為厭氧細菌.Melioribacter所屬的Ignavibacteria是綠菌門中唯1一一類化能自養菌,兼性厭氧(Podosokorskaya,2013),它與浮霉菌門的SM1A02都曾在厭氧氨氧化或其他具有反硝化功能的微生物系統中被檢測到(Chu,2015).而在氨氮抑制實驗以后,深入分析發現,隸屬于綠菌門的Ignavibacteria其比例由抑制前的28.72%下降到10.44%,這也是綠菌門比例下降的主要原因,另外屬于綠菌門(Chlorobi)的綠硫細菌(Chlorobia)的比例從1.53%上升到6.51%.屬于綠彎菌門的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)也在氨氮的作用下由之前的6.68%下降到3.09%.屬于浮霉菌門的Phycisphaerae抑制前占比13.97%,抑制后下降到0.99%.由此表明,氨氮對Ignavibacteria、Anaerolineae以及Phycisphaerae有明顯的抑制作用.而在變形菌門中,除Betaproteobacteria的比例從8.46%下降到6.58%外,Alphaproteobacteria,Deltaproteobacteria,Gammaproteobacteria其比例分別從8.75%,3.09%,14.63%上升至18.71%,5.20%,35.70%,這直接導致了在門的水平上,變形菌門比例的顯著上升,說明氨氮對變形菌門的促進作用主要集中在Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria以及Gammaproteobacteria.

通過對屬水平上群落結構的分析可發現,優勢菌種在高濃度氨氮作用下發生了改變,原本的優勢菌是屬于綠菌門的Melioribacter,但其比例從抑制前的19.66%下降到7.58%,說明該類菌對高氨氮的耐受性較差;屬于變形菌門的Methylomonas(甲基單胞菌屬),其比例從13.84%下降到0.01%,這種甲烷氧化細菌比例的下降,應是系統脫氮性能下降的原因之一,Methylomonas(甲基單胞菌屬)在甲烷濃度較低的環境中具有一1定的競爭力(Zeng,2016),Kim等在該菌屬的細菌中檢測到了編碼甲烷單加氧酶(MMO)的基因而甲烷單加氧酶是甲烷氧化過程的***步也是關鍵一步的催化劑(Kim,2016),同時在荷蘭的Lieshout污水處理廠底泥的DAMO分子檢測結果可知在系統發育樹中(Luesken,2011)、實驗室內富集成功的DAMO微生物的Illumina序列分析結果中(Siniscalchi,2017)等均有發現該菌屬的存在;屬于浮霉菌門的SM1A02,其比例從13.07%下降到0.26%;同時出現了新的優勢菌種,與Methylomonas(甲基單胞菌屬)同屬于變形菌門Gammaproteobacteria的Arenimonas其比例由0.01%上升到29.17%,說明該類細菌在受長期高濃度氨氮影響的DAMO細菌系統中具有一1定優勢,亦對高濃度氨氮有較強的耐受能力.該類細菌多為桿狀菌,革蘭氏陰性菌,無芽孢,無鞭毛,不可移動,但對于其在脫氮微生物系統中的作用尚不明朗.另外由于自然界中含有大量的不可培養或難以培養的微生物,導致眾多菌群的生物學分類是未知的,因而在序列信息比對過程中,數據庫中鑒定到屬水平的菌種只是自然界的一部分,大量的有效序列目前還無法找到合適的配對信息,同時表明,系統中囊括了未知菌屬,需要進一步深入探究.

綜上可知,在氨氮長期抑制作用下,DAMO細菌系統中物種豐度,多樣性以及群落結構發生較大改變,而Methylomonas(甲基單胞菌屬)的減少應是系統脫氮性能下降的主要原因.

4結論(Conclusions)

1)高濃度氨氮會影響DAMO微生物的生長和性能.在短期抑制條件下,氨氮對DAMO細菌的安全濃度為250mg˙L-1;當氨氮濃度增至500mg˙L-1時,DAMO細菌的脫氮效率受到明顯抑制,隨著濃度、時間的增加,氨氮對其的抑制效果增強;當氨氮濃度增加到1500mg˙L-1時,系統基本喪失脫氮性能.

2)抑制前后的污泥結構與微生物微觀形態特性經過掃描電鏡分析發現,高濃度氨氮短期抑制后,污泥結構均變得松散,絲狀菌大量繁殖,球狀菌和短桿狀菌則大量減少,污泥出現明顯的膨脹現象,同時微生物分泌大量EPS,以抵抗外界的不利環境.

3)在不同pH體系下,起到真正抑制作用的抑制因子不同,在堿性條件下,FA為主要抑制因子;在酸性條件下,離子化的氨氮為主要的抑制因子.

4)在相同氨氮抑制濃度下,與短期試驗相比較,長期抑制條件下DAMO細菌脫氮速率更低.氨氮濃度增加到1250mg˙L-1時,脫氮性能就被完全抑制.

5)高通量測序技術分析結果顯示,經長期的氨氮抑制后,DAMO系統內的物種多樣性和豐度都大大降低,菌群結構發生較大改變,變形菌門比例明顯上升,綠菌門、綠彎菌門及浮霉菌門比例下降.尤其是Methylomonas(甲基單胞菌屬)數量的減少,導致了系統脫氮效率降低.